// //
Дом arrow Статьи arrow Статьи arrow Исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ
Исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ, мигрирующих из полимерных строительных материалов


Ю.А.Соболь1,
Л.В.Половинкин1,
А.А.Ушков1,
Н.В.Гавриленко2,
А.М. Кульба2

ГУ «Республиканский научно-практический центр гигиены»1,
Белорусский государственный университет2

Изучено in vitro генотоксическое действие формальдегида, стирола, дибутилфталата, диоктилфталата и их различных комбинаций, на уровне гигиенических регламентов.
Ключевые
слова: генотоксичность, комбинированное действие, полимерные материалы.

Yu.A.Sobol1, L.V.Polovinkin1, A.A.Ushkov1, N.V.Gavrilenko2, A.M.Kulba2
Research of genotoxicity in experiences in vitro of the chemicals, migrating from polymeric building material
It is investigated in vitro genotoxicity of formaldehyde, styrene, dibutyl phthalate, dioctylphthalate and their various combinations, at a level of hygienic rules.
Key words: genotoxicity, the combined impact, polymeric material.

http://www.bsmu.by/bmm/03.2006/33.html

 

 

Широкое применение полимерных материалов (ПМ) в строительстве жилых и общественных зданий обуславливает увеличение влияния на организм человека химических факторов малой интенсивности. Важность и актуальность данной проблемы определяется тем, что большинство населения проводит в закрытых помещениях от 10 до 23 часов в сутки [4, 5].

Результаты проведенных нами санитарно-химических исследований [6] показали, что преимущественно из ПМ выделяются следующие химические вещества: формальдегид, дибутилфталат (ДБФ), диоктилфталат (ДОФ), стирол, которые обнаруживаются в пределах ПДК для атмосферного воздуха.

В настоящее время имеются данные, характеризующие генотоксический эффект формальдегида в концентрациях выше 2,4 мг/м3.[3]. Международное агентство по изучению рака в своей классификации относит формальдегид к 1 группе – как вещество канцерогенное для человека. Стирол по той же классификации относится к группе 2Б как возможный канцероген, обладая доказанными мутагенными свойствами [2]. ДБФ и ДОФ не обладают мутагенными и канцерогенными свойствами [7]. Однако, в литературе отсутствует информация, которая отражала бы генотоксическое действие комбинаций данных веществ, в связи с чем нами была предпринята попытка изучения их генотоксического действия на уровне гигиенических регламентов.

Большинство генотоксичных соединений активно взаимодействует с ДНК и вызывает в ней разнообразные повреждения. Нарушения в структуре ДНК, такие как разрывы нитей или поперечные сшивки, изменяют поведение всей макромолекулы, что и положено в основу определения ДНК-повреждающей активности химических соединений. Повреждения ДНК могут возникать при прямом химическом воздействии, таком как алкилирование оснований или косвенном действии, которое может быть химическим или ферментативным. Так, алкилированные пуриновые основания превращаются в апуриновые участки, а затем в однонитевые разрывы. Повреждения ДНК могут происходить и под влиянием ферментов, например для обнаружения нарушений структуры ДНК применяют ряд методов, среди которых наиболее простым и удобным является электрофорез [1].

Материал и методы

Для оценки генотоксического действия формальдегида, ДБФ, ДОФ, стирола и их комбинаций, использовали тестерную ДНК фага ? производства «Fermentas» (Вильнюс).

Поскольку исследуемые вещества (кроме формальдегида) не растворяются в воде, в качестве растворителя применяли диметилформамид (ДМФ). Конечные концентрации исследуемых веществ в реакционной смеси были следующими: формальдегид 0,05 мг/дм3, 0,1 мг/дм3, 0,2 мг/дм3; стирол 0,005 мг/дм3, 0,01 мг/дм3, 0,02 мг/дм3, 1,0 мг/дм3; ДБФ 0,125 мг/дм3, 0,25 мг/дм3, 0,5 мг/дм3, 1,0 мг/дм3; ДОФ 1,0 мг/дм3, 2,0 мг/дм3, 4,0 мг/дм3, 8,0 мг/дм3. Комбинации веществ: формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДОФ 2,0 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3.

При проведении электрофореза использовали прибор для горизонтального электрофореза, 0,9 % агарозный гель, 0,1 М трис-фосфатный буфер с 0,008 М ЭДТА. Интеркалирующий реагент – бромистый этидий, лидирующий краситель – бромфеноловый синий. Напряжение 12 В/см в течение 90 мин.

Прямое воздействие на ДНК фага ?. Объем реакционной смеси 20 мкл; 0,1М Трис-HCl буфер рН 7,4; ДНК фага ? = 0,15 мкг; исследуемое вещество или вещества. Конечная концентрация ДМФ во всех пробах, включая контрольные, составляла 20%.В маленьких пробирках Эппендорфа смешивали буфер, ДНК в физрастворе, и расчетное количество исследуемого вещества.

1. Смесь инкубировали в течение часа при 300С, затем в пробирки приливали по 10 мкл смеси, состоящей из буфера, глицерина и лидирующего красителя.

2. Смесь инкубировали в течение 3 часов при 300С и оставляли на 20 часов при комнатной температуре, затем в ячейки приливали по 10 мкл смеси, состоящей из буфера, глицерина и лидирующего красителя.

Воздействие на ДНК фага ? в системе метаболической активации. Объем реакционной смеси 20 мкл; 0,1М Трис-HCl буфер рН 7,4; пероксидаза хрена (ПХ) = 10-8 М; перекись водорода (Н2О2) = 10-3 М; ДНК фага ? = 0,15 мкг. Конечная концентрация ДМФ во всех пробах, включая контрольные, составляла 20%.

В маленьких пробирках Эппендорфа смешивали буфер, ДНК в физрастворе, раствор ПХ и расчетное количество исследуемого вещества или вещества. Реакцию начинали добавлением Н2О2. Смесь инкубировали в течение часа при 300С, затем в пробирки приливали по 10 мкл смеси, состоящей из буфера, глицерина и лидирующего красителя.

Для позитивного контроля в реакционную смесь вместо испытываемого вещества добавляли бензидин (БД) в возрастающей концентрации: 2,5*10-7; 5*10-7; 10-6; 2,5*10-6; 5*10-6; 10-5; 2,5*10-5; 5*10-5. Контролями также служили интактная ДНК фага ? (контроль в водном р-ре), ДНК фага ? (контроль 20% ДМФ), ДНК фага ? (контроль в водном р-ре) + ПХ + Н2О2, ДНК фага ? (контроль 20% ДМФ) + ПХ + Н2О2.

Приготовленные таким образом пробы вносили в гель (по 10 мкл на дорожку) и проводили электрофорез. Для обнаружения ДНК гели просматривали на трансиллюминаторе и сканировали в ультрафиолетовом свете.

Результаты и обсуждение

На дорожках (Рис. 1) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в водном р-ре); 2. ДНК фага ? + формальдегид 0,05 мг/дм3; 3. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3; 4. ДНК фага ? + формальдегид 0,2 мг/дм3; 5. ДНК фага ? + стирол 0,005 мг/дм3; 6. ДНК фага ? + стирол 0,01 мг/дм3; 7. ДНК фага ? + стирол 0,02 мг/дм3; 8. ДНК фага ? + стирол 1,0 мг/дм3; 9. ДНК фага ? (контроль в 20% ДМФ); 10. ДНК фага ? + ДБФ 0,125 мг/дм3; 11. ДНК фага ? + ДБФ 0,25 мг/дм3; 12. ДНК фага ? + ДБФ 0,5 мг/дм3; 13. ДНК фага ? + ДБФ 1,0 мг/дм3; 14. ДНК фага ? + ДОФ 1,0 мг/дм3; 15. ДНК фага ? + ДОФ 2,0 мг/дм3; 16. ДНК фага ? + ДОФ 4,0 мг/дм3; 17. ДНК фага ? + ДОФ 8,0 мг/дм3.

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 1. Электрофореграммы полученные после прямого воздействия на ДНК фага ? исследуемых веществ в различных концентрациях. Воздействие при 300С в течение часа.

На дорожках (Рис. 2) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в водном р-ре); 2. ДНК фага ? + формальдегид 0,05 мг/дм3; 3. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3; 4. ДНК фага ? + формальдегид 0,2 мг/дм3; 5. ДНК фага ? + стирол 0,005 мг/дм3; 6. ДНК фага ? + стирол 0,01 мг/дм3; 7. ДНК фага ? + стирол 0,02 мг/дм3; 8. ДНК фага ? + ДБФ 0,125 мг/дм3; 9. ДНК фага ? + ДБФ 0,25 мг/дм3; 10. ДНК фага ? + ДБФ 0,5 мг/дм3; 11. ДНК фага ? + ДОФ 1,0 мг/дм3; 12. ДНК фага ? + ДОФ 2,0 мг/дм3; 13. ДНК фага ? + ДОФ 4,0 мг/дм3.

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 2. Электрофореграмма полученная после прямого воздействия на ДНК фага ? исследуемых веществ в различных концентрациях. Воздействие при 300С в течение 3 часов и 20 часов при комнатной температуре.

На дорожках (Рис. 3) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в водном р-ре) + ПХ + Н2О2; 2. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + формальдегид 0,1 мг/дм3; 3. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + стирол 0,01 мг/дм3; 4. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + ДБФ 0,25 мг/дм3; 5. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + ДОФ 2,0 мг/дм3; 6. ДНК фага ? (контроль в 20% ДМФ) + ПХ + Н2О2.

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 3. Электрофореграмма полученная после инкубации ДНК фага ? в системе метаболической активации в присутствии исследуемых веществ.

На дорожках (Рис. 4) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в водном р-ре); 2. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3; 3. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДОФ 2,0 мг/дм3; 4. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; 5. ДНК фага ? + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; 6. ДНК фага ? + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; 7. ДНК фага ? (контроль в 20% ДМФ).

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 4. Электрофореграмма полученная после прямого воздействия на ДНК фага ? исследуемых веществ, смешанных в различных соотношениях. Воздействие при 300С в течение 3 часов и 20 часов при комнатной температуре.

На дорожках (Рис.5) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в 20% ДМФ) + ПХ + Н2О2; 2. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3; 3. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДОФ 2,0 мг/дм3; 4. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + формальдегид 0,1 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; 5. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; 6. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3;

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 5. Электрофореграмма полученная после инкубации в системе метаболической активации ДНК фага ? и исследуемых веществ, смешанных в различных соотношениях.

На дорожках (Рис.6) представлены: 1. ДНК фага ? (контроль в водном р-ре) + ПХ + Н2О2. 2. ДНК фага ? (контроль 20% ДМФ) + ПХ + Н2О2; Дорожки 3-10. ДНК фага ? + ПХ + Н2О2 + бензидин в возрастающей концентрации: 3 – 2,5*10-7; 4 – 5*10-7; 5 – 10-6; 6 – 2,5*10-6; 7 – 5*10-6; 8 – 10-5; 9 – 2,5*10-5; 10 – 5*10-5.

исследование генотоксичности в опытах in vitro химических веществ

Рис. 6. Электрофореграмма иллюстрирующая повреждение бензидином ДНК фага ? в системе метаболической активации

Как видно из электрофореграммы (Рис. 6.), продукты пероксидазного окисления бензидина вызывают в ДНК поперечные сшивки, что выражается в резком снижении электрофоретической подвижности ДНК, при этом ее часть (6 дорожка) или вся она деградирует (7-10 дорожки) и остается на старте. ДМФ, используемый в качестве растворителя веществ, не влияет на подвижность ДНК (2 дорожка).

Выводы

• В опытах in vitro генотоксического действия формальдегида (концентрации 0,05 мг/дм3, 0,1 мг/дм3, 0,2 мг/дм3); стирола (концентрации 0,005 мг/дм3, 0,01 мг/дм3, 0,02 мг/дм3, 1,0 мг/дм3); ДБФ (концентрациях 0,125 мг/дм3, 0,25 мг/дм3, 0,5 мг/дм3, 1,0 мг/дм3); ДОФ (концентрациях 1,0 мг/дм3, 2,0 мг/дм3, 4,0 мг/дм3, 8,0 мг/дм3) при прямом воздействии на ДНК фага ?, а также в системе метаболической активации не установлено.

• Исследованные комбинации веществ: формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДОФ 2,0 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; формальдегид 0,1 мг/дм3 + ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3; ДБФ 0,25 мг/дм3 + стирол 0,01 мг/дм3 не вызывают повреждений ДНК фага ?, изменяющих ее электрофоретическую подвижность, как при прямом воздействии, так и в системе метаболической активации, что позволяет говорить об отсутствии генотоксического действия у исследованных комбинаций веществ.

Литература

1. Абилев, С.К., Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений / С.К.Абилев, Т.Г.Пороменко // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Токсикология, 1986. – Т. 14. – С. 29-32.

2. Авилова, Г.Г. Стирол5 / Г.Г.Авилова, Е.А.Карпухина; под общей редакцией Н.Ф.Измерова // Научные обзоры советской литературы по токсичности и опасности химических веществ. – М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1984. – 28 с.

3. Германова, А.Л. Формальдегид / А.Л.Германова; под общей редакцией Н.Ф.Измерова // Научные обзоры советской литературы по токсичности и опасности химических веществ. – М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1982. – 20 с.

4. Губернский, Ю.Д. Методические аспекты эколого-гигиенической оценки современных строительных и отделочных материалов / Ю.Д.Губернский, Н.В.Калинина // Гигиена и санитария. – 1996. – № 1. – С.33-37.

5. Губернский, Ю.Д. Эколого-гигиенические аспекты организации мониторинга жилой среды / Ю.Д.Губернский, Н.В.Калинина, А.И.Мельникова // Гигиена и санитария. – 1997. – № 3. – С.46-49.

6. Соболь, Ю.А. Полимерные материалы применяемые в строительстве. санитарно-химическая оценка / Ю.А.Соболь, Л.В.Половинкин, Ю.А.Присмотров // Вестник фармации. – 2004. ВГМУ. – №4 (26). – С. 96-100.

7. Тимофеевская, Л.А. Эфиры о-фталевой кислоты / Л.А.Тимофеевская; под общей редакцией Н.Ф.Измерова // Научные обзоры советской литературы по токсичности и опасности химических веществ. – М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1983. – 58 с.

 

Контакты

115419, г. Москва, ул. Шаболовка, д. 34, стр. 3.



Просьба заранее предупредить о приезде, т.к. специалисты распределены по объектам




info@masterbetonov.ru




ООО «Стройсервис» работает на рынке строительного производства c 1992 года.
Основной ценностью для нашей компании являются клиенты, поскольку единственный реальный актив компании — это люди, удовлетворенные нашей работой, которые еще раз захотят воспользоваться нашими услугами. Мы стремимся сделать своих клиентов своими партнерами.